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帕金森病的基因治疗
加入时间:2004-9-27 13:22:30
   
    近年来基因治疗帕金森病显示了其良好的潜力和发展前途,但尚未进入临床阶段。基因治疗PD的原理就是通过在分子、基因水平上的操作,提高脑内DA的浓度,达到治疗目的。 

    一、 基因治疗PD的策略
    DA是酪氨酸经酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)作用生成左旋多巴,再经AADC催化而成。TH需四氢生物蝶呤(BH4)作为辅酶才能正常工作,而GTP环水解酶1(GTPCH)又是BH4生物合成的必须酶。因此提高TH、AADC和GTPCH酶的活性可望增加DA的水平。基因治疗PD的策略之一是将TH、AADC或GTPCH基因直接或间接地导入脑内以增加DA的合成。其二为导入神经营养因子基因,保护DA能神经元,减慢或防止纹状体区DA能神经元的进行性变性。 

    二、基因治疗PD的方法 
    ㈠ 目的基因的选择
    选择目的基因,是实施基因治疗的主要条件。当前所进行的研究均采用基因增加疗法,即通过非定点整合的外源目的基因所表达的正常产物,发挥对PD的治疗作用。已被选用的目的基因有以下几种。
1.TH基因 经外源正常TH基因修饰的细胞移植到PD鼠脑内,或者将TH基因直接导入脑内相应部位,使TH表达增加,DA生成增多,由于TH是DA合成的限速酶,因此是主要目的基因。
2.AADC基因 DA由左旋多巴经AADC作用转化而成,增加脑内AADC的活性可增加DA的水平,单独或联合转移AADC基因治疗PD的有效性已被大量的实验研究证实。
3.GTPCH基因 PD病人纹状体区GTPCH水平下降。以AAV作载体进行AAV.TH、AAV.AADC和AAV.GTPCH三种基因联合转导,显示较AAV.TH和AAV.AADC两种基因联合转导的效果更好,提示除TH和AADC外,GTPCH是基因治疗PD的重要目的基因。
4.DopD2R基因 PD病人除多巴能神经元受影响外,DA受体的功能也有缺陷,晚期纹状体区多巴胺D2受体(DopD2R)的水平明显下降。以复制缺陷型腺病毒(Ad)为载体介导DopD2R cDNA转染培养的组织细胞,用Northem分析检测到D2R cDNA;用[3H]spiperon(作为D2R片段特异性结合物)进行放射自显影分析,检测到膜受体D2R蛋白。首次提出了在神经递质受体水平进行基因治疗PD的策略。
5.BDNF基因 脑源性神经生长因子(BDNF)有保护DA能神经元、促进DA能神经元存活及预防其凋亡等特性,而被选为目的基因。
6.GDNF基因 胶质源性神经生长因子(GDNF)可增强DA能神经元的功能,有很强的特异性,能促进其存活和生长。其有效表达可延缓DA神经元的变性。
7.其他目的基因 有编码囊泡单胺转运体-2(VMAT-2)的基因、bFGF基因。
    ㈡ 表达载体的选择
    1.病毒载体 是将病毒基因组中某一处切除,由外源性基因代替,将外源基因导入神经系统内。常用的病毒载体有:
⑴ 逆转录病毒(RV)载体 为单链RNA病毒,除人类免疫缺陷病毒(HIV)外均可整合到宿主细胞的染色体上。由于神经元为有丝分裂后期细胞,RV转染神经元受到限制。
⑵ 单纯疱疹病毒(HSV)载体 为DNA病毒。HSV能感染包括神经元在内的多种细胞,为神经疾病基因治疗的有效载体。但有潜在的神经毒性,转基因表达不稳定及滴度不高等缺点,也有一定的危险性和较高的致瘤性。
⑶ 腺病毒(Ad)载体 Ad可用于静息期及分裂期细胞,高表达,转染率高,无原癌基因活性,神经毒性低等优点。缺点为:表达短暂,有致病性,可引起宿主免疫反应,有产生插入性突变的危险。
⑷ 腺相关病毒(AAV)载体 安全性好,所有病毒致病基因去除,能转染非分裂期细胞,表达稳定,是目前基因治疗PD中应用最多的病毒载体。但可插入的DNA片段小,有产生插入性突变的危险,对基因组的情况可控性差。
    2.非病毒载体 阳离子脂质体由表面带正电荷的双层脂质分子组成,能与带负电荷的DNA、RNA等多种阴离子物质结合成复合体(质粒DNA-阳离子脂质体复合体),可以通过细胞膜把目的基因移入细胞内,使目的基因表达。提高了转染率,又可以选择多种目的基因联合表达,既能加强对目的基因表达的调控,也避免了免疫反应和细胞毒性。
    ㈢ 目的基因导入法
    将外源目的基因高效导入靶细胞是基因治疗的重要步骤。真核细胞一般都能自动吸纳进外源DNA,但须借助各种方法提高导入效率。把外源基因导入靶细胞的方法有两大类:①理化方法:如DNA-磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖介导法、电穿孔法、脂质体介导法、显微注射及颗粒轰击法等;②生物学方法:主要是利用载有外源基因的复制缺陷病毒感染靶细胞。
    ㈣ 基因转移的途径
    基因转移有体内(in vivo)和体外(ex vivo)两种途径。
1.In vivo即直接将携带目的基因的载体注入到靶点,通过与周围组织的粘附、吞饮、渗透进入细胞内,并与周围组织的染色体整合或独自表达,表达产物的释放起到生物药物泵的作用而发挥治疗作用。HSV、Ad或AAV作为载体转染细胞,不需要靶细胞处于分裂相,适合于in vivo途径。
2. Ex vivo 先通过载体把目的基因转入培养的靶细胞内,在体外进行筛选、鉴定,再扩增,后将基因修饰细胞植入靶位。
    选择转移途径时,首先要考虑其有效性、安全性。In vivo途径方法简便、直接,但下列因素限制了它的应用:①转染效率低,易受体内溶酶体中核酸酶降解;②靶向性差,表达效率低;③载体尚不理想;④可控性差,无法进行筛选和鉴定,如何提高其靶向性和转染率亟待解决。Ex vivo途径的优势:①在体外通过基因修饰,可获得高表达的“DA能细胞”。②可将有协同作用的基因联合导入细胞。其主要问题是:①操作繁琐,可能会渗入对自体不利的因子;②难选择理想的靶细胞;③植入的靶细胞本身对周围脑组织有侵袭作用,有形成肿瘤的危险。
    ㈤ 靶细胞的选择
    采用ex vivo途径时,靶细胞的选择非常重要。当前用于基因治疗的靶细胞主要有①成肌细胞。②星形细胞:控制外源性基因插入位点保持内源基因的稳定性,星形细胞将可成为一种良好的靶细胞。③胚胎中脑细胞:用重组胚胎中脑细胞移植入纹状体内也可以提高胚胎移植的存活,解决胚胎移植需要量的问题,经扩增后移植,可提高脑内DA水平,代偿部分神经元的功能,起到治疗作用。④骨髓移植基质细胞:把人的骨髓基质细胞移植入纹状体内,可以避免免疫排斥反应,途径方便、可靠,是一种新尝试。
    ㈥ 靶点的选择
    靶点因选用的目的基因不同而不同。①以TH等作为目的基因时,一般选择纹状体为靶点(纹状体是DA的作用靶部位)。采用in vivo途径时,也可选择黑质(黑质是DA能神经元的胞体所在点),其合成的DA经黑质-纹状体通路到达纹状体而发挥作用。②神经营养因子作为目的基因,则对靶点的要求不十分重要。因为它在脑内许多部位均可发挥作用。 

    三、发展趋势
    PD病因不明,基因治疗可望在治疗上有新的突破。研究趋势为:①基因的选择向多基因联合转导的方向发展。②基因治疗与药物治疗联合能减少药物的用量和副作用,提高PD的疗效。③载体的选择向安全、有效、转染率高的方向发展。④对靶细胞更倾向于临床实验的应用,对其致瘤性仍需在基因重组和筛选上严格控制。
    目前存在的问题:药物诱导PD模型动物与自发PD病人在病因及病变上的相关性、外源基因在部位表达的长期性、基因表达的调控机制以及移植部位微循环对基因表达的影响等方面问题尚需解决。